一、试剂盒组成、储存、稳定性 试剂盒组成 保存 50 次 （DP7101） 100 次 （DP7102） 缓冲液 VB 室温 30 ml 60 ml 结合液 CB 室温 30 ml 60 ml 抑制物去除液 IR 室温 25 ml 50 ml 漂洗液 WB 室温 15 ml 25 ml 第一次使用前请加入指定量乙醇 洗脱缓冲液 EB 室温 15 ml 15 ml 蛋白酶 K （仅 II 型提供） -20℃ 20mg 冻干粉 2x20mg 冻干粉 微量吸附柱 室温 50 100 个 收集管（2ml） 室温 50 100 个 本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。 注意: 1． 第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量乙醇,充分混匀，加入后请及时在方框 打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 2． 结合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低温时可能出现析出和沉淀，可以在 37℃水浴 几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 3． 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶 K 为冻干粉状，收到后，可短暂离心后， 加入 400 微升或者 1 毫升灭菌水溶解(20mg/ml 终浓度)。因为反复冻融可能会降低酶 活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20 微升)分装冻存，-20℃保存。 4． 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。 二、原理简介 独特的结合液/蛋白酶 K 迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快 速的漂洗－离心的步骤, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质 去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱。 三、试剂盒特点 1． 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 2． 快速，简捷，单个样品操作一般可在 30 分钟内完成。 3． 多次柱漂洗确保高纯度,无抑制性杂质。 4． 本试剂盒用于从新鲜或者冷冻骨头样品中提取基因组 DNA。所得样 品可以直接用于 PCR、酶切、杂交等分子生物学实验。 四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！） 1． 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传 统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2． 开始实验前将需要的水浴先预热到 70℃备用。 3． 为了保证样本不被食物或饮料污染，取样前 30 分钟内请勿进食和 饮水。 五、操作步骤 * 第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇! 1. 处理材料：将适量骨头或软骨用液氮或破碎仪研成粉末， 转置于 2ml 离心管中， 加入 400μl 缓冲液 VB。 注意：如果需要去除 RNA，可加入 4μlRNaseA（100mg/ml）溶液（客户自备， 目录号：sp1001），振荡 15 秒，室温放置 5 分钟。 2. 加入 20μl 蛋白酶 K 溶液，涡旋 10 秒混匀，65℃放置 10 分钟，其间每 2 分钟涡旋 混匀数次。 3. 13000rpm 离心取上清，转入新的 1.5ml 离心管中，加入 400μl 结合液 CB，充分颠 倒混匀，70℃放置 10 分钟，此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液 滴。 注意 1: 加入缓冲液时可能会产生白色沉淀，一般 70℃放置时会消失，不会影 响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取量少和提 取出的不纯。 ,4. 加 200μl 无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。 注意：加入无水乙醇后可能会出现絮状沉淀，但不影响 DNA 提取。 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个微量吸附柱中（微量吸附柱放入收集管 中），12000rpm 离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将微量吸附柱放回收集管中。 6. 向微量吸附柱中加入 500μl 抑制物去除液 IR，12000 rpm 离心 30 秒，倒掉收集管中 的废液，将微量吸附柱放入收集管中。 7. 向微量吸附柱中加入 700μl 漂洗液 WB（使用前请先检查是否加入无水乙醇），12000 rpm 离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将微量吸附柱放回收集管。 8. 向微量吸附柱中加入 500μl 漂洗液 WB，12000 rpm 离心 30 秒，倒掉收集管中的废 液。 9. 将微量吸附柱放回收集管中，12000rpm 离心 2 分钟，倒掉废液。将微量吸附柱室 温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将微量吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会 影响后续的酶反应（酶切等）实验。 10. 将微量吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 20-50μl 洗脱 缓冲液 EB(洗脱缓冲液 EB 事先在 65-70℃预热)，室温放置 2-5 分钟，12000rpm 离 心 2 分钟。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于 20ul，体积过小影响回收效率。 为增加基因组的得率，可将离心得到的溶液再加入微量吸附柱中，室温放置 2 分 钟，12000rpm 离心 2 分钟。 洗脱液的对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其 PH 值在 7.0-8.5 范 围内（可以用将水的值调到此范围），PH 值低于 7.0 会降低洗脱效率；且 DNA 产物应保持在-20℃，以防 DNA 降解。