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DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断
DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断,符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间,低于此范围表明蛋白质含量超标,高于此范围表明样品中含有RNA。
一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发
我要纠正一下,纯DNA的A260/A280应大于1.8,纯的RNA应达到2.0,样品中如果含有蛋白质及苯酚,A260/A280比值会明显下降。对于纯的样品,只要读出260nm的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml双螺旋DNA,或者40微克/ml单链DNA(RNA),或者20微克/ml寡核苷酸计算。
OD260/OD280 1.9-2.0 RNA居多 纯度已经很高了
纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染)
纯RNA:1.7 <OD260/OD280<2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)
OD是optical density(光密度)的缩写, OD=1og(1/trans),其中trans为检测物的透光值。 吸光度 吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数,影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等 吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来,同一种物质,吸光系数就不变。 当一束光通过一个吸光物质(通常为溶液)时,溶质吸收了光能,光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示, A=abc,其中a为吸光系数,单位L/(gcm),b为液层厚度(通常为比色皿的厚度),单位cm ,c为溶液浓度,单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量,温度通过影响c,而影响A。
一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值,而OD是光密度值,一个意思。
A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准,纯的DNA一般在1.8-2.0之间;后来发现在抽提过程中使用的许多 试剂 影响 A260 和 A280 读数;同时,对同一样品 10 倍数量级稀释后测定吸光值发现,分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是:当 A260 读数处在 0.1-0.5 之间,A200 到 A320 之间的数值构成一条光滑的曲线时,
少量苯酚 (30 ul/ml) 残留使 A230,A260,A280 均变大 (差不多增加一倍),但 A260/A280 和 A260/A230 均在 2 左右。少量异硫氰酸胍 (132 uM) 残留使 A230 变大,但 A260,A280 几乎不变,所以 A260/A280 仍在 2 左右,而 A260/A230 大大低于 2。大量异硫氰酸胍 (2.4 M) 残留使 A230,A260,A280 均变大,根本就没有办法测定了。PEG (6.25%) 残留使 A230,A260,A280 均变大,但对 A230,A260 影响更大,所以 A260/A280 比 2 大不少,而 A260/A230 仍在 2 左右。
核酸抽提中常用的试剂,如 Phenol,Guanidine Isothiocyanate,PEG 都能使 A260 和A280 的值变大,但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为 A260 值几乎是峰值,所以有必要在其两边各取一个:A280 和 A230。干净的核酸 A260/A230 应该在 2 左右。如果有在230nm处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物
1.蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。
2.苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。
3.多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4.设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。
比值低可能有蛋白污染,高了可能有DNA污染,建议你抽提的RNA分三管,两管保存,另一管用来跑胶和测定OD,跑胶是最直观的,1%的胶就可以,抽提后马上跑,一般不会降解很多,所以设备材料不需要去酶处理
不会有影响的。你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸。可以试着调到8.0左右再测,这样就会上来了。
一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发
我要纠正一下,纯DNA的A260/A280应大于1.8,纯的RNA应达到2.0,样品中如果含有蛋白质及苯酚,A260/A280比值会明显下降。对于纯的样品,只要读出260nm的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml双螺旋DNA,或者40微克/ml单链DNA(RNA),或者20微克/ml寡核苷酸计算。
OD260/OD280 1.9-2.0 RNA居多 纯度已经很高了
纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染)
纯RNA:1.7 <OD260/OD280<2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)
OD是optical density(光密度)的缩写, OD=1og(1/trans),其中trans为检测物的透光值。 吸光度 吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数,影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等 吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来,同一种物质,吸光系数就不变。 当一束光通过一个吸光物质(通常为溶液)时,溶质吸收了光能,光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示, A=abc,其中a为吸光系数,单位L/(gcm),b为液层厚度(通常为比色皿的厚度),单位cm ,c为溶液浓度,单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量,温度通过影响c,而影响A。
一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值,而OD是光密度值,一个意思。
A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准,纯的DNA一般在1.8-2.0之间;后来发现在抽提过程中使用的许多 试剂 影响 A260 和 A280 读数;同时,对同一样品 10 倍数量级稀释后测定吸光值发现,分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是:当 A260 读数处在 0.1-0.5 之间,A200 到 A320 之间的数值构成一条光滑的曲线时,
少量苯酚 (30 ul/ml) 残留使 A230,A260,A280 均变大 (差不多增加一倍),但 A260/A280 和 A260/A230 均在 2 左右。少量异硫氰酸胍 (132 uM) 残留使 A230 变大,但 A260,A280 几乎不变,所以 A260/A280 仍在 2 左右,而 A260/A230 大大低于 2。大量异硫氰酸胍 (2.4 M) 残留使 A230,A260,A280 均变大,根本就没有办法测定了。PEG (6.25%) 残留使 A230,A260,A280 均变大,但对 A230,A260 影响更大,所以 A260/A280 比 2 大不少,而 A260/A230 仍在 2 左右。
核酸抽提中常用的试剂,如 Phenol,Guanidine Isothiocyanate,PEG 都能使 A260 和A280 的值变大,但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为 A260 值几乎是峰值,所以有必要在其两边各取一个:A280 和 A230。干净的核酸 A260/A230 应该在 2 左右。如果有在230nm处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物
1.蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。
2.苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。
3.多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4.设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。
比值低可能有蛋白污染,高了可能有DNA污染,建议你抽提的RNA分三管,两管保存,另一管用来跑胶和测定OD,跑胶是最直观的,1%的胶就可以,抽提后马上跑,一般不会降解很多,所以设备材料不需要去酶处理
不会有影响的。你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸。可以试着调到8.0左右再测,这样就会上来了。