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RNA酶污染的预防
RNA的化学性质比DNA活跃得多。RNA分子上紧邻磷酸二脂键的2′羟基基团能直接被RNA酶利用来作为活性因子,从而使得RNA酶无需金属离子就能发挥活性。由于RNA酶在环境中广泛存在,特别是RNase A,结构极其稳定,不能通过高温高压灭菌
失活,因而极难消除,对保持RNA样品的完整性构成极大的威胁。由于RNase A类酶依赖于活性位点处的组氨酸残基起催化作
用,因此能被组氨酸烷化剂DEPC所抑制。为了避免RNA降解,RNA相关实验都严格应遵循下述操作规则:
• 使用RNase-free溶液;
• 佩戴清洁一次性手套并经常更换;
• 建立RNA工作专区,使用专用的移液器和RNase-free枪头;
• 使用无菌的一次性塑料器皿,尽量避免使用玻璃器皿;
• 金属工具可以用快速灼烧数秒钟的方式来快速消除污染;
• 玻璃器皿可在180oC以上温度下烘焙数小时,或用新鲜配制的0.1%(v/v)DEPC或无水乙醇浸泡一小时后,高压灭菌去除残余
的DEPC;
• 电泳槽等含聚碳酸脂或聚苯乙烯材料的器皿应该在3%的过氧化氢中浸泡10分钟,然后用大量的RNase-free水冲洗干净后使用;
• 塑料制品可用新鲜配制的0.1%(v/v)的DEPC水浸泡过夜,然后高温高压灭菌1小时水解残留的DEPC;
• 试剂处理:
每升溶液中加入1 ml的DEPC,室温振荡过夜或37oC振荡1小时后,高温高压灭菌1小时水解残留的DEPC;
由于DEPC可以和初级氨基基团起反应,故含Tris的溶液不宜用DEPC处理。应使用新开瓶(RNA专用)的Tris粉末,溶于DEPC处理水或Milli-Q水中,使用RNA专用电极调整pH值后,高温高压灭菌;
对于遇热不稳定的化合物(如DTT、核苷、锰盐等),应直接将其(最高纯度)溶于DEPC处理水或Milli-Q水中,使用0.2 μm的滤膜过滤灭菌;
无水乙醇、异丙醇等试剂开瓶后作RNA专用;75%乙醇应使用无水乙醇与DEPC处理水配制。
• 反应体系中添加RNA酶抑制剂。