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TEM样品包埋块制作有关注意事项
一、取材与运输:
1、动作迅速:组织离体后,应将其快速放入固定液中,使组织细胞 尽可能保持原来的生活状态,在空气中暴露的时间越长,对结果的 影响就越大。细胞悬浮液离心,弃上清,PBS清洗2次,加入固定液4度 固定。注意取材的原则:尽量快(停止血供1min内放入固定液中)
、组织块小(1mm厚度)、4度条件下取材、固定液体积理论上为样 本体积的20倍以上。4度固定一天后,寄送。
2、减少损伤:选择锋利切割器械,减少牵拉或挤压组织;
3、组织大小与细胞量:组织尽量切成1mm3大小,如果无相关工具 ,我 公司 可代为切小。但请将目标区域切得尽量小,防止我们修样 时,选取的区域与您观察的不一致。如果检测标本为细胞,一般细胞量达到10的7次方,呈肉眼可见的团状。若细胞太少,对结果可能 会产生影响。
4、运输事项:将组织或者细胞完全浸泡在2.5%戌二醛中4度运输,
要保证完全浸泡,样品容器中的空气越少越好。
透射电镜样品制作扭作流程
1) 取材
2) 漂洗(生理盐水)
3) 前固定(2.5%戌二醛,4°C冰箱2小时以上)
1) 漂洗(0.1M嶙酸缓冲液,3次,45分钟)
2) 后固定(1%锇酸1小时左右)
3) 漂洗(0.1M磷酸缓冲液, 3次,45分钟)
4) 块染(1%醋酸铀2小时)
5) 梯度脱水(50%、 70%、 80%、 90%、 100% 丙酮各 15分钟,100% 2次,各10分钟)
6) 浸透(丙酮:包埋液=1 : 1, 37°C烘箱2
小时;丙酮:包埋液=1 : 4, 37C烘箱过夜;纯包埋液 45C烘箱2小时)
7) 包埋聚合(45 C烘箱3小时,65 C烘箱48小时)
8) 修块
9) 半薄切片光镜定位
10) 挑选并清洗好载网,在载网上覆盖支持膜
11) 超薄切片
戌二醛固定液的配置
(a)磷酸缓冲液的配方:
A液:0.2M磷酸氢二钠贮备液:
Na2HPO4-2H2O 或:Na2HP04.7H20 或:Na2HP04.12H20
加双蒸水至 500毫升
B液:0.2M磷酸二氢钠贮备液
NaH2PO4 • H2O 13.8 克
或:NaH2P04 • 2H20 15.61 克
加双蒸水至 500毫升
使用时将A液40.5ml和B液9.5ml混合成0.2嶙酸缓冲液。(PH7.4)
(b) 2.5%戌二醛固定液的配方:
0.2M磷酸缓冲液 50毫升
25%戌二醛溶液(电镜专用) 10毫升
加双蒸水至 100毫升
戌二醛溶液最终浓度:pH值7.3-7.4
1、动作迅速:组织离体后,应将其快速放入固定液中,使组织细胞 尽可能保持原来的生活状态,在空气中暴露的时间越长,对结果的 影响就越大。细胞悬浮液离心,弃上清,PBS清洗2次,加入固定液4度 固定。注意取材的原则:尽量快(停止血供1min内放入固定液中)
、组织块小(1mm厚度)、4度条件下取材、固定液体积理论上为样 本体积的20倍以上。4度固定一天后,寄送。
2、减少损伤:选择锋利切割器械,减少牵拉或挤压组织;
3、组织大小与细胞量:组织尽量切成1mm3大小,如果无相关工具 ,我 公司 可代为切小。但请将目标区域切得尽量小,防止我们修样 时,选取的区域与您观察的不一致。如果检测标本为细胞,一般细胞量达到10的7次方,呈肉眼可见的团状。若细胞太少,对结果可能 会产生影响。
4、运输事项:将组织或者细胞完全浸泡在2.5%戌二醛中4度运输,
要保证完全浸泡,样品容器中的空气越少越好。
透射电镜样品制作扭作流程
1) 取材
2) 漂洗(生理盐水)
3) 前固定(2.5%戌二醛,4°C冰箱2小时以上)
1) 漂洗(0.1M嶙酸缓冲液,3次,45分钟)
2) 后固定(1%锇酸1小时左右)
3) 漂洗(0.1M磷酸缓冲液, 3次,45分钟)
4) 块染(1%醋酸铀2小时)
5) 梯度脱水(50%、 70%、 80%、 90%、 100% 丙酮各 15分钟,100% 2次,各10分钟)
6) 浸透(丙酮:包埋液=1 : 1, 37°C烘箱2
小时;丙酮:包埋液=1 : 4, 37C烘箱过夜;纯包埋液 45C烘箱2小时)
7) 包埋聚合(45 C烘箱3小时,65 C烘箱48小时)
8) 修块
9) 半薄切片光镜定位
10) 挑选并清洗好载网,在载网上覆盖支持膜
11) 超薄切片
戌二醛固定液的配置
(a)磷酸缓冲液的配方:
A液:0.2M磷酸氢二钠贮备液:
Na2HPO4-2H2O 或:Na2HP04.7H20 或:Na2HP04.12H20
加双蒸水至 500毫升
B液:0.2M磷酸二氢钠贮备液
NaH2PO4 • H2O 13.8 克
或:NaH2P04 • 2H20 15.61 克
加双蒸水至 500毫升
使用时将A液40.5ml和B液9.5ml混合成0.2嶙酸缓冲液。(PH7.4)
(b) 2.5%戌二醛固定液的配方:
0.2M磷酸缓冲液 50毫升
25%戌二醛溶液(电镜专用) 10毫升
加双蒸水至 100毫升
戌二醛溶液最终浓度:pH值7.3-7.4